La grande majorité des tissus humains et animaux peuvent être cultivés in vitro, mais le degré de difficulté est directement lié au type de tissu, au degré de différenciation, à l'âge du donneur et à la méthode de culture primaire. La culture primaire est la première étape critique de la culture de cellules tissulaires et affectera directement le déroulement normal des expériences ultérieures. Dans ce numéro, nous aborderons les exigences de base en matière d'échantillonnage et les méthodes d'échantillonnage de divers types de tissus.
Exigences de base pour l'échantillonnage
Les tissus doivent être transformés en cellules dans un délai de 4 à 6 heures. Si le tissu ne peut pas être cultivé à temps, il peut être immergé dans une solution de culture et placé dans un bain de glace ou dans un réfrigérateur à 4 degrés. Si le bloc de tissu est très grand, il doit être coupé en petits morceaux de moins de 1 cm3 avant la cryoconservation, mais le temps ne doit pas dépasser 24 heures.
Le matériel doit être prélevé de manière strictement aseptique, en utilisant des ustensiles emballés stériles ou des articles faciles à transporter tels que des flacons pré-stérilisés contenant une petite quantité de solution de culture (contenant de la pénicilline et de la streptomycine).
Lors du prélèvement du matériel et de la culture primaire, utilisez des instruments tranchants tels qu'un scalpel pour déchiqueter le tissu afin de minimiser les dommages mécaniques aux cellules.
Pour les échantillons de tissus contenant du sang, de la graisse, du tissu nerveux, du tissu conjonctif et du tissu nécrotique, retirez-les avec précaution ; pour éviter le dessèchement des tissus pendant l'isolement, faites-le dans un récipient contenant une petite quantité de liquide de culture.
Pour la culture primaire, en particulier pour les cellules normales, un milieu de culture riche en nutriments doit être utilisé, de préférence avec du sérum fœtal bovin.
En général, les tissus embryonnaires sont plus faciles à cultiver que ceux des individus matures, et ceux présentant une faible différenciation sont plus faciles à cultiver que ceux présentant une forte différenciation.
Afin de faciliter l’identification ultérieure de l’origine des tissus primaires et l’observation des différences entre les cellules et les tissus d’origine après culture in vitro, des échantillons histologiques et des échantillons microscopiques électroniques doivent être conservés pour l’échantillonnage primaire.
Équipement et fournitures de base pour l'échantillonnage :
Étape 1 : Ciseaux courbes pour tissus ophtalmiques, pinces courbes, scalpel (stérilisés avant utilisation) ;
Étape 2 : Flacons contenant du milieu sans sérum ou une solution de Hanks ;
Étape 3 : Petits béchers (10 ml, 50 ml).
Étape 4 : Boîtes de Petri.
Différentes méthodes d’échantillonnage de tissus
Échantillonnage de tissu embryonnaire de souris
Étant donné qu'il y a plus de micro-organismes cachés dans les poils des souris et qu'ils ne sont pas facilement stérilisés, il est plus important de prêter attention à la désinfection aseptique lors du prélèvement de tissus, et leur désinfection aseptique est généralement effectuée par les méthodes suivantes :
1. Tuer l'animal en lui amorçant le cou puis en immergeant tout son corps dans un bécher contenant 75 % d'éthanol pendant 3 à 5 minutes, en prenant soin de ne pas prendre trop de temps pour éviter que l'éthanol ne pénètre dans le corps par la bouche et d'autres orifices et n'affecte la viabilité des tissus ;
2.Retirez-le et placez-le sur une plaque de fixation stérilisée et fixez-le avec un goujon stérilisé ou une aiguille à grosse tête ;
3. Coupez la peau avec des ciseaux ophtalmiques et une pince hémostatique pour disséquer et retirer le matériau.
Alternativement, après stérilisation à l'éthanol, la peau peut être coupée en cercle au milieu du torse de l'animal, et l'animal peut être tiré vers la tête et la queue avec une pince hémostatique pour exposer le torse, puis fixé pour la dissection et l'extraction. Le tissu prélevé doit être placé dans une autre boîte stérile propre ou sur une plaque de verre pour l'opération de culture primaire. Une fois l'animal stérilisé, l'opération doit être réalisée sur une table ultra-propre ou dans un environnement stérile.
Collecte de tissus d'embryons de poulet
En général, les embryons de poulet doivent être auto-incubés lorsqu'ils sont utilisés. Les principales étapes sont les suivantes : sélectionner des œufs fraîchement fécondés, essuyer la surface et les incuber dans un incubateur à 37 degrés avec un plat d'eau pour maintenir l'humidité dans l'incubateur. En général, on utilise des embryons de 9-12 d ans et les œufs sont retournés une fois par jour pendant cette période. Dans des conditions stériles, les œufs sont placés dans un petit bécher avec la chambre à air (grande extrémité) vers le haut et stérilisés avec de l'iode et de l'éthanol. La coquille de l'œuf à l'extrémité de la chambre à air a été retirée par une coupe circulaire avec des ciseaux, la membrane de l'œuf a été ouverte pour exposer l'embryon, et l'embryon a été délicatement ramassé en atteignant l'œuf avec une tige de verre à pointe incurvée émoussée et placé dans une boîte de Petri stérile, où le matériel a été prélevé selon les besoins.
Collection de peau et de muqueuses
En général, la peau et les muqueuses sont principalement prélevées à partir des tissus retirés pendant l'opération ; si nécessaire, elles peuvent être prélevées séparément. La méthode est similaire à la procédure chirurgicale de prélèvement de sections de peau, mais la zone est généralement de 2 à 3 mm2. Cela ne laisse aucune cicatrice locale. Notez que le matériel ne doit pas être désinfecté avec de l'iode, mais rincé avec une solution antibiotique hautement concentrée si nécessaire.
Ablation de viscères et de tumeurs solides
Lors du prélèvement de tumeurs viscérales et solides, il est important d'être clair et familier avec le type et l'emplacement des tissus nécessaires, et de couper et de retirer les parties indésirables telles que les vaisseaux sanguins, les nerfs et les tissus conjonctifs entre les tissus.
Prélèvement de cellules sanguines
En général, le sang est prélevé dans les veines, mais en petites quantités, il peut également être prélevé au bout des doigts ou au lobe de l'oreille. Pour éviter la coagulation, on utilise souvent un anticoagulant à base d'héparine. La quantité d'anticoagulant doit être la plus petite quantité produisant un effet anticoagulant, et une quantité trop importante peut entraîner une hémolyse. La concentration courante d'héparine est de 20 U/mL, et la seringue doit être humidifiée avec une concentration plus élevée d'héparine (500 U/mL) avant de prélever le sang. Le sang doit être prélevé dans des conditions d'asepsie strictes.
Prélèvement de cellules dans la moelle osseuse, le liquide amniotique, le liquide pleural et l'ascite
Ces échantillons ne nécessitent généralement aucun autre traitement après l’échantillonnage et sont mieux cultivés immédiatement après centrifugation et ne doivent pas être conservés à basse température.